امروزه استفاده از تکنیک‌های انجماد یک روش بسیار پرکاربرد در آزمایشگاه‌ها برای نگهداری نمونه است. با این وجود نباید از موضوع تأثیر انجماد بر کیفیت و پایداری نمونه‌ غافل شد.

به منظور حفظ مواد بیولوژیکی در شرایط بهینه، لازم است فرایند انجماد به آهستگی انجام شود. دستورالعمل‌‌های مختلفی برای انجماد نمونه ارائه شده است. اما در این منابع، کمتر به چگونگی تأثیر انجماد بر کیفیت نمونه پرداخته می‌شود.

مروری بر بیوپریزرویشن

جهت بررسی تأثیر انجماد بر کیفیت نمونه در آزمایشگاه بهتر است ابتدا با واژه‌ی “بیوپریزرویشن” بیشتر آشنا شویم.

فرآیند ذخیره سازی نمونه در آزمایشگاه اغلب با عنوان بیوپریزرویشن شناخته می‌شود.

این فرایند شامل چهار مرحله‌ی اصلی است:

•   آماده سازی نمونه

•   انجماد

•   ذخیره سازی

•   ذوب یا دفریز کردن

 این مراحل از طریق فرایندی به نام هیپوترمی (Hypothermic) به هم مرتبط هستند.  در اینجا هیپوترمی به این معنی است که رویدادهایی یک فرایند، بر مراحل مجاور، (مراحل قبلی یا بعدی در طول همان فرایند) تأثیر می‌گذارند.

طی فرایند دفریز (ذوب) و انجماد ممکن است سلول آسیب ببیند و نمونه کیفیت کافی برای بازیابی و آزمایش را نداشته باشد. هدف نهایی بیوپریزرویشن، قرار گرفتن نمونه در شرایطی است که امکان بازیابی مجددد آن پس از انجماد وجود داشته باشد. یعنی به ساختارهای بیولوژیکی نمونه تا حد امکان آسیبی وارد نشود.

اما چگونه می‌تواند از تاثیر انجماد بر کیفیت نمونه کاست؟

در پاسخ به این سوال، باید گفت که انجماد از جنبه‌های گوناگونی ممکن است به سلول آسیب برساند. در ادامه به بررسی هریک از این جنبه‌ها خواهیم پرداخت.

تاثیر انجماد بر کیفیت نمونه به لحاظ فیزیکی

تاثیر انجماد بر کیفیت نمونه به لحاظ فیزیکی به معنی آسیب ساختاری به غشاها، اندامک‌ها، پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک است.

نگهداری نمونه در آزمایشگاه مستلزم کاهش دمای آن است. یعنی دمای نمونه باید از دمای نرموترمیک[۱] (معمولاً ۳۷ درجه سانتی‌گراد) به دمای ذخیره‌سازی نهایی (دمای فریزر UTL یا نیترژن مایع) برسد.

دمای نرموترمیک حالتی است که دمای هسته بدن در محدوده استاندارد تنظیم می‌شود. در انسان، دمای نرموترمیک ۳۶٫۴ الی ۳۷٫۸ درجه سانتی‌گراد در نظر گرفته می‌شود.

اما این فرایند کاهش دما چندان هم ساده نیست. قبل از فاز خنک‌سازی، نمونه‌ها در محیطی حاوی یک عامل محافظ سرما (مانند DMSO، گلیسرول، اتیلن گلیکول و غیره) قرار می‌گیرند.

سپس برای چند دقیقه (معمولا کمتر از ۳۰ دقیقه) در دمای حدود ۴ درجه سانتی‌گراد نگهداری می‌شوند تا تعادل ایجاد شود.

خنک‌سازی نمونه باید با سرعت کنترل‌شده تقریباً ۱- درجه سانتی‌گراد در دقیقه صورت گیرد. این امر منجر به کم آبی سلولی می‌شود و غلظت انجماد املاح درون سلولی (نمک‌ها، یون‌ها، عوامل انجمادی و غیره) را کاهش می‌دهد. به این ترتیب احتمال تشکیل یخ در داخل سلول کاهش خواهد یافت.

انجماد چگونه باعث آسیب به ساختار فیزیکی سلول می‌شود؟

کم آبی سلولی باید تا زمانی ادامه یابد که دما به زیر دمای انتقال شیشه‌ای[۲] (Tg) برسد. یعنی نقطه‌ای که در آن نمونه به حالت شیشه‌ای تبدیل می‌شود. به عنوان مثال Tg آب خالص تقریباً ۱۳۵– درجه سانتی‌گراد است.

کم آبی سلولی در کاهش احتمال تشکیل یخ درون سلولی بسیار مفید است. به این ترتیب می‌توان از تاثیر انجماد بر کیفیت نمونه کاست. اما این موضوع نباید در طول ذخیره‌سازی نمونه رخ دهد.

اگر نمونه در دمایی بالاتر از Tg ذخیره شود، کم آبی در طول ذخیره‌سازی نمونه ادامه می‌یابد و منجر به افزایش آسیب می‌شود. با ادامه کم آبی نمونه‌ها، آسیب ساختاری به غشاها، اندامک‌ها، پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک رخ می‌دهد. اگر آسیب خیلی شدید باشد ممکن است منجر به از دست رفتن نمونه بلافاصله پس از ذوب شود.

تاثیر انجماد بر کیفیت نمونه به لحاظ مولکولی

تاثیر انجماد بر کیفیت نمونه می‌تواند در سطح مولکولی نیز رخ دهد. این امر اغلب به دلیل موارد زیر اتفاق می‌افتد.

۱) کاهش انرژی و فعالیت متابولیک

۲) جداسازی مسیرهای بیوشیمیایی

 ۳) فعال شدن مسیرهای پاسخ به فشار مولکولی

بیایید نگاهی به علت این موضوع داشته باشیم.

طی فرآیند ذخیره‌سازی، کاهش دما منجر به کند شدن متابولیسم و مسیرهای بیوشیمیایی می‍‌شود. در نتیجه سطوح انرژی جنبشی کاهش می‌یابد. به عبارت دیگر کاهش ۱۰ درجه سانتی گراد معادل ۳ درصد کاهش در انرژی حرارتی است.

در اصل، ذخیره سازی نمونه در دمای پایین، تمام واکنش‌های بیوشیمیایی سلولی را کندتر می‌کند. اما اگر نمونه در دمای بالاتر از  Tg ذخیره شود، این فرایندها متوقف نمی‌شوند. ادامه یافتن واکنش‌های بیوشیمیایی منجر به آسیب مداوم به نمونه‌ها می‌شود. در نتیجه سلول، اجزای درون سلولی، DNA، RNA، پروتئین، باکتری یا ویروس آسیب خواهند دید.

از طرف دیگر، این واکنش‌ها اغلب تنظیم‌نشده و ناقص هستند. به همین دلیل منجر به تشکیل و تجمع ترکیبات واسطه سمی، مانند رادیکال‌های آزاد، محصولات جانبی متابولیسم بی‌هوازی و محصولات زائد می‌شوند. این محصولات جانبی می‌توانند منجر به آسیب مستقیم یا فعال شدن پاسخ‌های فشار مولکولی پس از ذوب شوند. به عنوان مثال، تولید و تجمع رادیکال‌های آزاد در طول ذخیره‌سازی نمونه، می‌تواند به طور مستقیم به DNA، پروتئین و یکپارچگی میتوکندری در سلول‌ها آسیب برساند.

نشانه‌های این آسیب ممکن است بلافاصله پس از ذوب مشهود نباشد. در واقع چندین ساعت تا چند روز طول می‌کشد تا این اثرات شناسایی شوند.